Il Duomo di Urbino è la chiesa principale della città e cattedrale dell'arcidiocesi di Urbino-Urbania-Sant'Angelo in Vado. Si è mantenuta della grandezza simile alla precedente cattedrale rinascimentale, demolita dal terremoto del 1789, e ricostruita in gusto neoclassico; misura in lunghezza 64,5 m, in larghezza 36,8 m e in altezza 50 m. È dedicata a santa Maria Assunta.
Fondata nel 1021, in sostituzione di una precedente chiesa fuori le mura, la cattedrale urbinate aveva una pianta originariamente ruotata di 90° rispetto a quella attuale, ed era di dimensioni assai minori. Ricostruito nel XV secolo su istanza di Federico da Montefeltro, il duomo di Urbino fu edificato secondo un progetto semplicissimo e spoglio, a tre navate su bianchi piloni, secondo un progetto attribuito al senese Francesco di Giorgio Martini che in quegli anni era architetto di fiducia del duca. L'edificio fu terminato nel 1604.
Questa singolare opera del Rinascimento andò perduta con il terremoto del 12 gennaio 1789 con il crollo della cupola, che costrinse gli urbinati a ricostruire la loro cattedrale affidando il progetto all'architetto romano Giuseppe Valadier (1762-1839), che concluse l'edificio nel 1801.
La facciata, in pietra del Furlo, è opera di Camillo Morigia (1743-1795) e realizzata nel 1782, su commissione dell'arcivescovo Domenico Monti, è ornata da cinque statue, sul frontone, rappresentano le Virtù Teologali (Fede, Speranza e Carità), mentre sui due spioventi, vi sono rappresentati Sant'Agostino (a sinistra) e San Giovanni Crisostomo (a destra). Sotto al frontone è riportata l'iscrizione "STUDIORUM UNIVERSITATI FASTIGIUM", come ringraziamento all'Università per aver finanziato i lavori per la realizzazione del tetto. La gradinata antistante il Duomo è stata sistemata in forme attuali nel 1859 su disegno dell'arcivescovo Alessandro Angeloni, presenta, al termine di una elegante balaustra, sulla sinistra la statua del Patrono San Crescentino e sulla destra la statua del Compatrono Beato Mainardo, Vescovo di Urbino.
Il raffinato interno, opera del Valadier, è un bell'esempio di stile neoclassico: a croce latina, con tre bianche navate coperte da volta a botte, è coronato, all'incrocio del transetto, da una maestosa cupola cassettonata.
Tra le opere d'arte si segnalano due tele (il San Sebastiano (1557), la Santa Cecilia (1555), nella navata destra e la bellissima Ultima Cena nella cappella del Sacramento, 1603-1608) di Federico Barocci, un'Assunta di Carlo Maratta (1707 circa) e la Natività della Vergine di Carlo Cignani (1708).
Nei pennacchi della cupola, i tondi con gli Evangelisti, sono opere di artisti di scuola romana del XVIII secolo (tra cui Domenico Corvi e Giuseppe Cades). La pala dell'altar maggiore, che troneggia nell'abside, con la Madonna tra i santi protettori di Urbino, è di Cristoforo Unterperger.